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基因编辑到底会不会脱靶?中国科学家用最新研究给出了解答

鬼谷藏龙 发表于  2019-03-01 15:36

|·?本文来自“我是科学家”·|

自从以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术被发明以来,有一个词就像幽灵般盘旋在这个领域中,那就是“脱靶”。人人都讨论它,人人都害怕它,但却没人看得到它。

图片来源:Pixabay

然而在昨天,这个幽灵终于被人抓住了,中科院神经所杨辉实验室团队与合作者开发了一套名为GOTI的新技术,让基因编辑的脱靶从此无所遁形,相关论文发表在3月1日的《科学》(Science)上[1]。

GOTI新技术让基因编辑的脱靶从此无所遁形。

一枪打在了别人的靶子上

在2004年雅典奥运会男子50米步枪三姿决赛中,美国选手埃蒙斯遥遥领先,到了要打最后一枪的时候,他已然遥遥领先第二名整整三环。胜卷在握的他屏息凝神开了这一枪,又一次把子弹准确送到了差不多是靶心的位置,然而他的记分牌上却显示出一个匪夷所思的成绩:

脱靶。

原来埃蒙斯犯了一个莫名其妙的错误——他最后一枪打在了别人的靶子上。

埃蒙斯:我怎么会……图片来源:GETTY IMAGES

奥运会的顶尖选手如此,生命科学的顶尖技术亦是如此。

近年来很火的技术“基因编辑”,就有这个问题。尽管以CRISPR/Cas9等为代表的新一代基因编辑以精确著称,但它们时不时就是会犯这种“打到别人靶子上”的毛病——我们本来要让它去编辑A基因,但它却意外搞坏了B基因。

基因编辑的脱靶和奥运选手的脱靶一样都是极小概率的事件,但常在河边走哪能不见鬼,每一次基因编辑操作,本质上都是成千上万的基因编辑工具对着成千上万的细胞做了成千上万次编辑,焉能保证次次不失手呢?

图片来源:图虫创意

奥运选手脱靶最多丢块金牌,基因编辑脱靶了,丢的没准就是性命了。然而基因编辑技术宛如一辆势不可挡的战车,正以雷霆万钧之势向着临床领域疾驰而来。

然而这历史的车轮真的不能挡吗?又该不该挡一下呢?

查明脱靶率可没那么容易

还是拿奥运会打个比方吧,虽然奥运选手脱靶是个小概率事件,但是只要观察的次数足够多,就能够统计出他平均中靶多少次会出现一次脱靶,这个就是就叫做“脱靶率”。

知道了脱靶率,我们才能制定一个标准。比如说规定平均一万枪内不能出现超过一次脱靶,张三脱靶率是千分之一,那他就不合格;李四脱靶率千万分之一,那他就值得信赖。

然而颇显尴尬的是,这么多年来,无论是支持基因编辑脱靶还是反对基因编辑脱靶,大家很大程度都只凭着一种“信仰”,却从来没有人真正弄清过基因编辑的脱靶率到底是多少。

这是因为,基因编辑的脱靶率真的太难检测了。

射击运动员的脱靶率可以直接“数”出来,基因编辑的脱靶率该怎样计算呢?也许有人会说,这很简单呀,把一批样本分成两组,一组做基因编辑,一组不做,然后比对一下两组的基因差异不就成了么?

2017年, Bassuk等几位科学家还真就这么干了[2],他们用CRISPR/Cas9技术编辑了几枚小鼠的受精卵,等这些受精卵发育成小鼠出生后检测了它们的基因,并将其与同一品系的其它小鼠作对比,结果居然发现了“一千多处难以预料的基因突变”。

尽管这个结果立马成了各大媒体的头条,但它却受到了学术圈内一致的口诛笔伐,因为这个检测犯了一个很低级的错误:世界上没有两只基因完全一样的小鼠。Bassuk的实验无法区分比对出来的基因差异究竟来自于基因编辑,还是小鼠之间本来就有的个体差异。

在一片指责声中,来自中科院神经科学研究所杨辉实验室的博士后左二伟(还记得吗?就是那个敲染色体的 CRISPR又有新用场了!这或许是唐氏综合征患者的福音 )却萌生了一个清奇的想法,当时他一拍大腿说,艾玛好机会啊,只要立刻用非常严谨的科学方法重做一下论文的工作,然后得出否定的结论反驳它,不就白捡一篇Nature methods嘛。

做着做着,他就发现,这个“非常严谨的科学方法”其实并不简单(不然早几年全世界的科学家不就早该做了么)。更惨的是,他的工作铺开没过多久,Bassuk的论文就被撤稿了(详情请见:震惊!国际顶尖期刊宣布CRISPR有毒!震惊again!它又撤稿了?。?。

不过,左二伟博士还是决定研究下这个问题,世界上不是有一句魔咒叫做“来都来了”嘛,顺便做做看吧……

一念之间的历史的走向

经过与导师的讨论,一个可以精准检测脱靶的方案还真的慢慢成型了。然而正是在左二伟博士“顺便”研究脱靶问题的这段时间里,基因编辑临床化的脚步却在日益加快。

2018年1月,美国批准了宾州大学一项利用CRISPR/Cas9修复免疫缺陷的临床试验。

2018年8月,欧洲多个国家批准了张锋的CRISPR Therapeutics公司的用CRISPR/Cas9治疗β地中海贫血症的临床试验。

2018年11月,解放军总医院的基于基因编辑T细胞治疗癌症的临床试验申请也被通过。

更遑论2018年11月份,原南方科技大学副教授贺建奎公然宣布自己做出了人类首例基因编辑婴儿。细思极恐的是,贺建奎之后,居然还有不少力挺他的声音,其中不乏国际最顶尖的科学家。

张锋和David Liu等等也是极大地加快了基因编辑临床化的速度。

张锋在他的实验室中。 图片来源:sciencenews.org

毕竟,谁第一个取得了临床化基因编辑的突破,谁就率先霸占了一块医疗的制高点,这其中的利益真的太诱人了。乃至一时之间万马奔腾,有些人似乎已经不在乎这其实还是一项风险未知的技术了。

突然之间,左二伟博士乃至整个杨辉实验室都好像无意中站在了历史的节点上,这个随手做做的课题突然将会变得足以决定这个领域的历史走向——

检测出来如果证明基因编辑不易脱靶当然皆大欢喜,但如果证明它容易脱靶呢?且不说杨辉自己实验室里那些涉及基因编辑向临床转化的课题将面临考验,还可能由此在行业内掀起一场地震。

最终,左二伟博士在与导师杨辉研究员以及所长蒲慕明等人商议后,大家还是决定继续做下去,毕竟……

得有人站出来承担这个责任呀。

检测脱靶,阻碍重重

阻碍检测脱靶率的,除了“个体差异”外,还有另一个障碍。

什么障碍呢?我们继续用射击做比方:能得分的目标靶子通常是唯一的,而目标外的“别人家的靶子”可就是千千万万各有不同了。想象一下,如果随便撒一把CRISPR/Cas9去编辑十万个细胞的基因,假设每个都脱靶,且这些脱靶都是随机产生的,那么这十万个细胞最多就会有十万种脱靶,每一种脱靶形式只占了所有样本的十万分之一,这种微乎其微的异常几乎不可能被检测出来。

因此,脱靶检测需要依赖所谓的“单细胞测序”,通俗来说,就是实验组和对照组都只有一个细胞。这样的对比当然就能很容易发现差别,但是很显然,一个细胞那一丁点DNA是根本不够拿来检测的。为了解决这个矛盾,就要用到“体外扩增”技术,把那一丁点DNA样本复制成千上万份,直到数量满足检测所需为止。

但是,人类发明的任何体外扩增体系都是不完美的,无法做到100%精确拷贝最初的DNA样本,每一次复制都会带入一丁点错误。就像复印文稿总比原稿品质差一些一样,经过千万次复制再复制,就足以让这份DNA样本变得面目全非,干扰检测结果。

多次下载图片再重新上传也会导致图片文件出现明显的“劣化”。

这一切引入的“噪音”甚至比脱靶信号本身还要高出好几个数量级,这宛如是在汪洋大海中寻找一滴水一般。

一举三得该如何实现?

找到这滴水的唯一办法就是让大海(各种干扰因素)消失。左二伟博士与导师杨辉还真的想到了一种绝妙的方式,同时解决了这三个问题。

为了避免个体差异,我们又需要找到两个基因一模一样的细胞,为了凸显脱靶的信号,我们又需要用到“单细胞测序”,然后我们还不能用体外扩增来复制这两个细胞的DNA,却又需要很大量的DNA样本来做测序分析。

首先最容易解决的就是找两个基因完全一模一样的细胞。我们知道,多数动物都是从一个受精卵发育而来的,这个受精卵一分为二,二分为四……等等,在它一分为二的时候,我们称之为“二细胞期胚胎”阶段,不就是两个现成的基因一模一样的细胞吗?

只要向其中一个注射基因编辑工具,另一个就是世界上最佳的对照。

其次,一个细胞的DNA不是不够检测么?没关系,注射完毕后我们直接把这个二细胞胚胎植入母鼠的子宫当中,让它正常发育,这样得到的小鼠胚胎中,理论上就有一半细胞经历过基因编辑,另一半则没有经历过过。

这时候,左二伟博士直接将发育长大的小鼠胚胎取出来,用一些特殊的酶消化成一大堆分散的细胞。利用一些方法,我们可以追踪当时那两个细胞的后代,从这一堆细胞中将它们俩各自的后代分成两拨。由于这两拨细胞也是之前的细胞分裂而来,所以它们的基因就相当于是最初那个细胞的复制品。

这也顺便解决了第三个问题,裂解掉这一大堆足以构建出半个小鼠胚胎的巨量细胞,一次性就能提取到足够测序分析的DNA,从而避免了体外扩增带来的噪音。

在神经所蒲慕明所长的建议下,研究团队将这套系统命名为GOTI??梢运?,这套系统的推出,标志着人们终于得以用数字来衡量基因编辑的脱靶率。

GOTI的技术流程:在二细胞期向一个卵裂球注射基因编辑工具,并用CRE使之本身以及后代细胞都发出红色荧光。等小鼠胚胎发育到14.5天后取出母体,利用流式细胞仪将两个卵裂球的后代分开,并各自全部消化掉提取DNA来做测序分析。

哪种基因编辑易脱靶?我们挨个测一下

终于到了检测工具一显身手的时候。它接下来要帮助人们回答的关键问题就是:那些常见的基因编辑工具真的会脱靶吗?在GOTI的神威下,一切清晰了起来。

首先,值得庆幸的是,最经典的spCas9系统经受住了考验。结果显示,它引起异?;蛲槐涞目赡苄圆桓哂谛∈笞陨硐赴至汛吹谋镜谆蛲槐?。就是说,从目前的检测结果来看它是安全的。

CRISPR-Cas9系统已经成为目前最方便的基因编辑工具。图片来源:origene.com

与此同时最令人大跌眼镜的发现是,另一类叫做单碱基突变系统(Base Editor)的基因编辑工具有着异常高的脱靶率。所谓的单碱基突变系统,大致上可以理解为我们先设计一个只能精确靶向但不会切割DNA的Cas9蛋白,然后让这个Cas9蛋白牵着一个能够通过化学方法将某个碱基定向突变(比如A→T)的酶来给DNA链中引入点突变。

原本这套系统因为不会引入DNA断裂,被视为特别安全的一类基因编辑技术,人们从来不觉得它会脱靶,之前的脱靶检测也完全没有发现它有任何脱靶的迹象。因此以刘如谦(David Liu)等为代表的一群科学家长期都在致力于将这项技术作为基因编辑向临床进军的急先锋。

通过检测发现,经典的CRISPR/Cas9并没有显著的脱靶现象,但是单碱基编辑系统BE3则出现了高出背景基因突变水平数倍的脱靶现象。

这时候研究团队才突然意识到,就算Cas9没有在sgRNA带领下跟任何DNA序列结合,那个能够引起碱基定向改变的酶也依旧存在,它完全可以像任何在细胞里游离的酶一样,让任何偶然接触自己的碱基发生化学反应。这样的系统天然就有高脱靶率的,可能之前大家对“没有DNA链断裂就没有脱靶”形成了思维定势,才会忽视这一安全漏洞。

长久以来,因为缺少令所有人都信服的脱靶检测技术,基因编辑的脱靶问题被吵吵嚷嚷了五年多,也让这个领域在此期间一直处于野蛮生长的状态。

图片来源:图虫创意

如今,GOTI出现了,规则还会远吗?(编辑:Yuki)

参考文献:

  1. Zuo, E.#, Sun, Y.#, Wu, W.#, Yuan, T.#, Ying, W., Sun, H., Yuan, L., Steinmetz, L., Li, Y.*, Yang, H.*(2019)Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos. Science Online
  2. Schaefer, K. A., Wu, W. H., Colgan, D. F., Tsang, S. H., Bassuk, A. G., & Mahajan, V. B. (2017). Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nature methods, 14(6), 547-548.

作者名片

热门评论

  • 2019-03-02 11:15 Karlson

    这就叫“识破不值半文钱”,他们成功的实现了之后,再把原理讲出来,即使我们这种非这个领域的人,也都会一拍大腿,这tm多简单啊。业内的人,恐怕还得加上一句:我tm当初也这么想过啊。

    [6] 评论
  • 2019-03-01 16:30 天降龙虾

    这是否是说,贺建奎搞出来的基因编辑婴儿,她们的健康其实还是可以得到保证的???

    [6] 评论
  • 2019-03-01 21:17 毛骡 金属材料学博士
    引用@天降龙虾 的话:这是否是说,贺建奎搞出来的基因编辑婴儿,她们的健康其实还是可以得到保证的???

    不,是就怕万一出问题怎么办。

    [3] 评论

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全部评论(21)
  • 1楼
    2019-03-01 16:30 天降龙虾

    这是否是说,贺建奎搞出来的基因编辑婴儿,她们的健康其实还是可以得到保证的???

    [6] 评论
  • 2楼
    2019-03-01 21:17 毛骡 金属材料学博士
    引用@天降龙虾 的话:这是否是说,贺建奎搞出来的基因编辑婴儿,她们的健康其实还是可以得到保证的???

    不,是就怕万一出问题怎么办。

    [3] 评论
  • 3楼
    2019-03-02 11:15 Karlson

    这就叫“识破不值半文钱”,他们成功的实现了之后,再把原理讲出来,即使我们这种非这个领域的人,也都会一拍大腿,这tm多简单啊。业内的人,恐怕还得加上一句:我tm当初也这么想过啊。

    [6] 评论
  • 4楼
    2019-03-02 17:48 超级无敌小仙女

    ,

    [0] 评论
  • 5楼
    2019-03-03 14:59 汉尼拔wang
    引用文章内容:结果显示,它引起异?;蛲槐涞目赡苄圆桓哂谛∈笞陨硐赴至汛吹谋镜谆蛲槐?。就是说,从目前的检测结果来看它是安全的。

    X man 呼之欲出~

    [1] 评论
  • 6楼
    2019-03-03 22:17 54434
    引用@天降龙虾 的话:这是否是说,贺建奎搞出来的基因编辑婴儿,她们的健康其实还是可以得到保证的???

    可以进行检测,但是那些按反转商人的逻辑,那个婴儿本身就是个大肿瘤,活不长,所以你说什么都不管事:我不听我不听我不听!

    [0] 评论
  • 7楼
    2019-03-03 22:22 神秘进化记录

    又迈出了里程碑的一步,可喜可贺~

    [0] 评论
  • 8楼
    2019-03-05 10:15 q68257962

    没看出来新方法如何规避自身细胞分裂带来的突变,也没看出旧方法为什么不能得出“它引起异?;蛲槐涞目赡苄圆桓哂谛∈笞陨硐赴至汛吹谋镜谆蛲槐洹钡慕崧?。

    [1] 评论
  • 9楼
    2019-03-05 10:53 CBP
    引用@54434 的话:可以进行检测,但是那些按反转商人的逻辑,那个婴儿本身就是个大肿瘤,活不长,所以你说什么都不管事:我不听我不听我不听!

    如今可以检测对人类当试验体的情况来说没有意义啊,那两个小孩据说已经出生了.而为什么很多人支持转基因作物而不支持人类的基因编辑的原因就在于,转基因作物育种脱靶了,没关系,直接删选掉,失败品进垃圾堆就是了,安全无害也没有人会说你残忍杀害农作物对吧,可是人类怎么办?把那两个小孩掐死?还是说一辈子软禁以防止他们污染人类基因库?

    [1] 评论
  • 10楼
    2019-03-06 21:14 54434
    引用@CBP 的话:如今可以检测对人类当试验体的情况来说没有意义啊,那两个小孩据说已经出生了.而为什么很多人支持转基因作物而不支持人类的基因编辑的原因就在于,转基因作物育种脱靶了,没关系,直接删选掉,失败品进垃圾堆就是了...

    文中所讲的应该是在合适的培养条件下,在胚胎发育初期就可以进行检测,堕胎在大部分情况下除天主教之外并不涉及任何问题,所以在未来应该是很有前景的,只不过由于现在人们价值观及道德观不允许所以暂时没有条件应用??商逋庾庸共⒉怀墒?,还是再等个几十年吧

    [0] 评论
  • 11楼
    2019-03-06 21:15 54434
    引用@CBP 的话:如今可以检测对人类当试验体的情况来说没有意义啊,那两个小孩据说已经出生了.而为什么很多人支持转基因作物而不支持人类的基因编辑的原因就在于,转基因作物育种脱靶了,没关系,直接删选掉,失败品进垃圾堆就是了...

    乍一看以为馒头老妖呢,你头像太有迷惑性了

    [0] 评论
  • 12楼
    2019-03-07 13:18 章鱼丸子II世
    引用@天降龙虾 的话:这是否是说,贺建奎搞出来的基因编辑婴儿,她们的健康其实还是可以得到保证的???

    不是健康的问题,是该不该做,起码是,现在该不该做的问题。这涉及伦理道德问题,基因编辑婴儿可以去掉某些疾病,哪么有一天,某人说把我后代的基因编辑下,让我的后代成为超级健康超级聪明的人,那该怎么办?如果某政府说,搞一批基因编辑婴儿,让他们成为超级战士,怎么办?这些事儿,现在人类还没想清楚该如何应对。

    [0] 评论
  • 13楼
    2019-03-07 14:44 天降龙虾
    引用@章鱼丸子II世 的话:不是健康的问题,是该不该做,起码是,现在该不该做的问题。这涉及伦理道德问题,基因编辑婴儿可以去掉某些疾病,哪么有一天,某人说把我后代的基因编辑下,让我的后代成为超级健康超级聪明的人,那该怎么办?如果某...

    俺知道。。。俺现在只是关心那俩已经被转了基因的孩子是否能有比较大的概率是健康的,至于别的伦理规范和管理的问题,可以以后再说吧。。。。

    [0] 评论
  • 14楼
    2019-03-13 11:34 霜焰
    引用@毛骡 的话:不,是就怕万一出问题怎么办。

    万一变成惊奇队长怎么办?

    [0] 评论
  • 15楼
    2019-03-13 11:36 霜焰
    引用@天降龙虾 的话:俺知道。。。俺现在只是关心那俩已经被转了基因的孩子是否能有比较大的概率是健康的,至于别的伦理规范和管理的问题,可以以后再说吧。。。。

    极大概率是普通路人甲,有什么隐患的概率和天生武功盖世天下无敌的概率是一样的。

    [0] 评论
  • 16楼
    2019-03-13 12:11 毛骡 金属材料学博士
    引用@霜焰 的话:万一变成惊奇队长怎么办?

    变成臭臭泥的几率都比变惊奇队长高

    [0] 评论
  • 17楼
    2019-03-15 22:18 霜焰
    引用@毛骡 的话:变成臭臭泥的几率都比变惊奇队长高


    无论是变成惊奇队长还是臭臭泥,都不是目前的基因能做到的,几率都是0%,0%=0%,怎么会高?

    [0] 评论
  • 18楼
    2019-03-17 14:43 你这是自寻箱子
    引用@天降龙虾 的话:这是否是说,贺建奎搞出来的基因编辑婴儿,她们的健康其实还是可以得到保证的???

    理论上是。

    然而本位面的地球人类的技术和理论往往不能统一。

    [0] 评论
  • 19楼
    2019-03-17 19:26 这个昵称没有被人使用
    引用文章内容:胜卷在握的他

    文章发出来作者自己看过吗?……

    [0] 评论
  • 20楼
    2019-03-18 09:50 毛骡 金属材料学博士
    引用@霜焰 的话: 无论是变成惊奇队长还是臭臭泥,都不是目前的基因能做到的,几率都是0%,0%=0%,怎么会高?

    这里要求极限!

    [0] 评论
  • 21楼
    2019-03-18 11:18 天降龙虾
    引用@你这是自寻箱子 的话:理论上是。然而本位面的地球人类的技术和理论往往不能统一。

    所以我们有时需要一点小迷信?????

    [0] 评论

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